嗜热裂解酶融合蛋白靶向作用产气荚膜梭菌

新和盈
2020-12-21

盈解读:

细胞裂解酶的CAT结构编码的内肽酶、糖苷酶和酰胺酶,可靶向作用产气荚膜梭菌细胞壁上的肽聚糖结构中的不同连接键裂解细胞,杀死产气荚膜梭菌。本试验筛选了嗜热地衣芽孢杆菌含有裂解CAT结构域DNA序列和不同产气荚膜梭菌裂解酶CWB结构域DNA列进行聚合酶链式反应,通过基因克隆技术制备重组裂解酶,该酶展现出良好的耐高温和对产气荚膜梭菌的抑菌作用。希望对您和行业有所帮助。




Thermophile Lytic Enzyme Fusion Proteins that Target Clostridium perfringens

嗜热裂解酶融合蛋白靶向作用产气荚膜梭菌

主要结果:

1与对照组相比,Y412CAT(来源于地芽胞杆菌基因组Y412MC61)Y4CAT(来源于地芽胞杆菌基因组Y4.1MC1)GVE2CAT(来源于深海嗜热噬菌体E2)与不同产气荚膜梭菌的CWB结构(包括菌株CP10CWBCP18CWBCP33CWBCP41CWBCP26FCWB重组裂解不同的产气荚膜梭菌菌株Cp39Cp509Cp734CpJGS1504CpJGS1659表现不同程度裂解作用;其中GVE2CAT-CP33CWB GVE2CAT-CP41CWBY412CAT-CP18CWBY412CAT-CP33CWB重组裂解酶对所有测试的产气荚膜梭菌有良好的裂解作用说明:重组裂解酶起到裂解杀灭产气荚膜梭菌的作用

2天然产气荚膜梭菌菌株Cp18裂解酶(PlyCP18)热稳定性较差,在60均已失活。但PlyCP18相比,Y412CAT重组裂解酶和GVE2CAT重组裂解酶60℃仍有一定的留存率其中Y412CAT-CP26FCWBGVE2CAT-CP26FCWB70℃80℃有一定的酶活,甚至GVE2CAT-CP41CWB重组裂解酶在90℃仍有留存率。表明重组裂解酶具有一定的热稳定性,耐高温。

3Y4CAT-CP26FCWB裂解产气荚膜梭菌菌株CP39CP734CPJGS1504CPJGS1659无抑菌作用外,GVE2CATY4CATY412CAT与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶均可抑制产气荚膜梭菌菌株(CP39CP509 CP734CPJGS1504CPJGS1659)的生长。且GVE2CATY412CAT重组裂解酶对产气荚膜梭菌的抑菌效果更佳。

重组裂解酶GVE2CAT-CP33CWBGVE2CAT-CP41CWB的最小抑菌浓度大于100 μg/mL YY412CAT-CP33CWBYY412CAT-CP41CWB的最小抑菌浓度为100 μg/mLY4CAT-CP33CWB的最小抑菌浓度为25-100 μg/mL。然而,Y4CAT-CP41CWB的抑菌效果最佳,最小抑菌浓度1.6-6.3 μg/mL


方法与材料:

通过GenScript对大肠杆菌密码子优化DNA序列克隆到大肠杆菌表达载体pET-21a(+)NdeIXhoI位点,合成嗜热芽孢杆菌细胞裂解合成基因PlyGsPY412(基因库ACX77322预测N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性EC 3.5.1.28PlyGspY4(基因库ADP73474内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性EC 3.2.1.96PlyGVE2(基因库ADP73474N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性EC3.5.1.28)这些酶的CAT结构域和产气荚膜梭菌细胞裂解PlyCP10PlyCP18PlyCP33PlyCP41PlyCP26FCWB结构域的DNA序列进行PCR扩增整合pET-21a(+)载体,完成克隆载体的构建。

检测重组蛋白酶的裂解酶活性、热稳定性和对产气荚膜梭菌的最小抑菌浓度。抑菌试验选取的菌株有:产气荚膜梭菌菌株 Cp39、产气荚膜梭菌菌株Cp509、产气荚膜梭菌菌株Cp734、产气荚膜梭菌菌株JGS1504、产气荚膜梭菌菌株 JGS1659、蜡样芽孢杆菌菌株Bc17、粪肠球菌菌株EF-17、艰难梭菌菌株ATCC 700057无乳链球菌、金黄色葡萄球菌菌株。


主要图表说明:

1 产气荚膜梭菌细胞壁的聚糖结构和水解酶裂解位点裂解

1)葡糖胺糖苷酶在N-乙酰基氨基葡萄糖(GlcNac)和N-乙酰基尿酸(MurNac)之间切割位点

2)胞壁质酶(溶菌酶)和裂解性转糖基酶在MurNacGlcNac之间切割位点。

3L-丙氨酸酰胺酶在MurNac和肽链的第一个氨基酸丙氨酸之间切割位点。

4)内肽酶在肽链中或交叉肽链间肽键切割位点。

5)细菌肽聚糖具有复杂的结构,其糖主链由N-乙酰氨基葡糖(GlcNac)和N-乙酰山梨酸(MurNac)残基的交替单元组成,并通过MurNac上的寡肽连接(肽链),寡肽通过肽桥链接。细胞裂解酶CAT结构编码的内肽酶、糖苷酶和酰胺酶,可靶向作用肽聚糖结构中的不同;连接键裂解细胞。


2 嗜热嵌合裂解酶重组示意图

1PlyGsPY412PlyGspY4PlyGVE2提供氨基端催化域(CAT结构域),即412CATY4CATGVE2CAT

2)产气荚膜梭菌提供碳端结构域,CP10CWBCP18CWBCP33CWBCP41CWBCP26FCWB

3Thermophile Lysins:嗜热裂解酶;Chimeric Lysins:嵌合裂解酶;Amidase酰胺酶glucosaminidase: 氨基葡萄糖苷酶


6 嗜热芽孢杆菌细胞裂解酶合成基因Y412 CATY4 CATGVE2 CAT和融合蛋白的裂解活性

1)图A Y412 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶活;图BY412 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶酶活;图C GVE2 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶酶活

2黑色:缓冲液对照组;蓝色:与产气荚膜梭菌CP10菌株CWB结构域融合重组裂解酶;橙色与产气荚膜梭菌CP18菌株CWB结构域融合重组裂解酶灰色:与产气荚膜梭菌CP33菌株CWB结构域融合重组裂解酶黄色:与产气荚膜梭菌CP41菌株CWB结构域融合重组裂解酶深蓝色:与产气荚膜梭菌CP26F菌株CWB结构域融合重组裂解酶

3)横坐标反应时间;纵坐标吸光值(OD值),数值降低则代表产气荚膜梭菌裂解数量越多



7 重组嵌合裂解酶的平板裂解分析

1)重组嵌合裂解酶可有效裂解产气荚膜梭菌可裂解产气荚膜梭菌。

2)图中透明圆圈(黑色)代表重组嵌合溶菌酶裂解产气荚膜梭菌细胞


8裂解酶融合蛋白的热稳定性

1)重组裂解酶融合蛋白具有较好的热稳定性。

2)图A   Y412 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶热稳定性;图BY412 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组裂解酶热稳定性;图C GVE2 CAT结构域与不同产气荚膜梭菌CWB结构域重组细菌裂解酶热稳定性

3)亮蓝色:与产气荚膜梭菌CP10菌株CWB结构域融合重组裂解酶;橙色:与产气荚膜梭菌CP18菌株CWB结构域融合重组裂解酶;灰色:与产气荚膜梭菌CP33菌株CWB结构域融合重组裂解酶;黄色:与产气荚膜梭菌CP41菌株CWB结构域融合重组裂解酶;深蓝色:与产气荚膜梭菌CP26F菌株CWB结构域融合重组裂解酶;绿色:产气荚膜梭菌CP18裂解酶

3Temperature:温度;Residual Activity:留存率


1 细胞裂解对产气荚膜梭菌菌株和其他细菌的影响

1)重组裂解酶可抑制产气荚膜梭菌的生长。

2Lysin:细胞裂解酶;Clostridium perfringens:产气荚膜梭菌;Other Bacteria:其它菌株:Cp39:产气荚膜梭菌菌株 Cp39Cp509:产气荚膜梭菌菌株Cp509Cp734:产气荚膜梭菌菌株Cp734JGS1504:产气荚膜梭菌菌株JGS1504JGS1659:产气荚膜梭菌菌株 JGS1659Bacillus cereus Bc17蜡样芽孢杆菌菌株Bc17Entero-coccus faecalis EF-17:粪肠球菌菌株EF-17Clostridium difficile ATCC 700057艰难梭菌菌株ATCC 700057Strepto-coccus agalactiae:无乳链球菌、Staphylo-coccus aureus 305:金黄色葡萄球菌菌株。

3):裂解反应速度-标准差≤5+/—5<裂解反应速度-标准差15+15<裂解反应速度-标准差45++45<裂解反应速度-标准差135+++:裂解反应速度-标准差135+越多表示裂解酶对产气荚膜梭菌的裂解效果越好,抑菌作用越强。


2 嵌合细胞裂解酶对产气荚膜梭菌菌株Cp39的最小抑菌浓度

1Y4CAT-CP41CWB的抑菌效果最佳,最小抑菌浓度为1.6-6.3μg/mL

2Chimeric Lysin:嵌合细胞裂解酶;MIC range:最小抑菌浓度范围




翻译:张倩玉、张罕星                          校对:林映才                          排版:张明然、刘立

如有疑问请联系:刘立13922311549



阅读 25
分享
写评论...